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          技術(shù)文章
          活性氧探針:氨基苯基熒光素APF/羥苯基熒光素HPF

          Probes for reactive oxygen species(活性氧ROS探針)技術(shù)專題

           

          Aminophenyl fluorescein (APF) 氨基苯基熒光素

          Hydroxyphenyl fluorescein (HPF) 羥苯基熒光素

           

          專題關(guān)鍵詞:

          Aminophenyl fluorescein (APF);Hydroxyphenyl fluorescein (HPF);Reactive oxygen species (ROS) 活性氧物質(zhì);DCFH-DA;CAS:359010-69-8;

           

          基本描述:

          氨基苯基熒光素(APF)和羥苯基熒光素(HPF)是由T. Nagano開發(fā)的兩種活性氧(Reactive oxygen species, ROS)指示劑,比H2DCFDA(DCFH-DA, DCFH)具更的特異性和穩(wěn)定性。APF和HPF顯示有限的非選擇性反應(yīng),和相對較高的光誘導(dǎo)氧化抗性。APF和HPF具細(xì)胞膜滲透性,本身無熒光,直到與羥基自由基或過氧亞硝基陰離子反應(yīng),還能與次氯酸陰離子反應(yīng),產(chǎn)生強綠色熒光(Ex/Em,~490/515nm),可用熒光顯微鏡、高通量成像儀、熒光酶標(biāo)板或流式細(xì)胞儀檢測。

           

          工作原理:

          中性溶液中氨基苯基熒光素(APF)和羥苯基熒光素(HPF)幾乎是無熒光,當(dāng)與高活性氧物質(zhì)(highly reactive oxygen species, hROS)反應(yīng),能夠生成具有高熒光強度的熒光素(Ex/Em, 490/515nm),且能觀察到熒光強度的增加【見下反應(yīng)原理圖】。

           

          探針特征:

          □  APF,HPF選擇性檢測hROS比如羥基自由基(HO•)和過氧亞硝基陰離子(ONOO–),但不會與其他活性氧物質(zhì)反應(yīng)(•O2–,1O2, H2O2, NO等);

          □  通過加入辣根過氧化物酶(HRP)能定量測定過氧化氫H2O2;

          □  結(jié)合使用HPF和APF能特異性檢測次氯酸(OCl-);

          □  HPF和APF本身根本不會自氧化,從而與其他試劑相比能得到更可靠的數(shù)據(jù);

          □  能對活細(xì)胞進行成像檢測;

           

          ROS探針檢測特異性比較:

          □  試劑配制:1mg HPF/APF分別溶于DMF配制成5mM儲存液。使用前用磷酸鹽溶液(0.1M, pH 7.4)稀釋500~5000倍(10~1μM)。將稀釋液加入樣本并孵育,然后測定熒光值(Ex/Em, 490/515nm)。

          □  磷酸鹽緩沖液體系(0.1M, pH 7.4),每一種熒光試劑(終濃度:10mM,0.1% DMF用作共溶劑)與各種活性氧物質(zhì)反應(yīng)。

          □  HPF(Ex/Em=490/515nm), APF(Ex/Em=490/515nm), DCFH(Ex/Em=500/520nm)的熒光強度測定。

                     表1. 活性氧探針(HPF, APF, DCFH)對各種活性氧物質(zhì)的反應(yīng)特異性

          ROS               

          HPF (MX4805-1MG)    

          APF (MX4804-1MG)       

          DCFH (MX4802-50MG)   

          HO•

          730

          1200

          7400

          ONOO–

          120

          560

          6600

          OCl-

          6

          3600

          86

          1O2

          5

          9

          26

          •O2–

          8

          6

          67

          H2O2

          2

          <1

          190

          NO

          6

          <1

          150

          ROO•

          17

          2

          710

          Autoxidation

          <1

          <1

          2000

           

          ROS探針應(yīng)用示例:

          示例1:細(xì)胞經(jīng)光誘導(dǎo)的自氧化檢測(Light-induced autoxidation in cells)

          1.1    探針加量:37℃避光孵育細(xì)胞30min,HPF或DCFH-DA(10mM each)

          1.2    熒光測定:共聚焦顯微鏡觀察熒光(激發(fā)波長488nm,檢測波長>515nm);488nm波長輻射刺激細(xì)胞10s,然后再測定熒光。

          1.3    實驗圖片:

           

          示例2:豬中性粒細(xì)胞的體內(nèi)成像(Bioimaging of porcine neutrophils)

          2.1 豬中性粒細(xì)胞的純化

          a)從豬血中純化中性粒細(xì)胞;b)將純化的中性粒細(xì)胞溶于KRPD緩沖液(Krebs-Ringer phosphate buffer)(114 mM NaCl, 4.6 mM KCl, 2.4 mM MgSO4, 1.0 mM CaCl2, 15 mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.4),置于冰上直至使用。將其轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿內(nèi)。

          2.2 探針加載與PMA刺激

          a)加10mM HPF或APF到細(xì)胞,室溫孵育30min。b)加入佛波酯PMA(2ng/ml)刺激中性粒細(xì)胞;

          2.3 中性粒細(xì)胞的體內(nèi)成像

          刺激前或刺激后10min用共聚焦顯微鏡觀察中性粒細(xì)胞(激發(fā)波長488nm,觀察波長505nm-550nm)。

           

          產(chǎn)品信息:高品質(zhì)產(chǎn)品,現(xiàn)貨供應(yīng),咨詢,maokangbio內(nèi)容。

          貨號

          名稱

          規(guī)格           

          價格(元)  

          MX4804-1MG          

          Aminophenyl fluorescein (APF) 氨基苯基熒光素

          1mg

          2080

          MX4805-1MG

          Hydroxyphenyl fluorescein (HPF) 羥苯基熒光素

          1mg

          2080

          MX4802-50MG

          H2DCFDA (DCFH-DA, DCFH) 活性氧(ROS)熒光探針   

          50mg

          546

          【溫馨提示】:見我司(懋康生物)整理的Probes for reactive oxygen species(活性氧探針)產(chǎn)品專題。

           

          相關(guān)產(chǎn)品:ROS研究常用的配套產(chǎn)品,需要了解更多信息咨詢,maokangbio內(nèi)容。

          貨號

          名稱

          規(guī)格

          價格(元)  

          MX4801-1KIT

          Reactive Oxygen Species (ROS) Assay Kit

          活性氧(ROS)檢測試劑盒

          100~500T    

          328

          MZ2401-100UL

          PMA (TPA, 5mg/ml)佛波肉荳蔻醋酸(5mg/ml)

          100μl

          280

          MS5603-50ML

          tert-Butyl hydroperoxide solution (TBHP)

          叔丁基過氧化氫溶液

          50ml

          98

          MP5429-10MG

          N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)

          N-甲酰-蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸

          10mg

          588

          M36008(Invitrogen)

          MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator      

          50 µg

          650

           

          注意事項

          為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

           

           — —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

           

           

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