細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑

TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)

細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（綠色熒光）

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞內(nèi)特異性核酸內(nèi)切酶活化，染色質(zhì)DNA在核小體間被特異性切割，DNA降解成180~200 bp或其它整數(shù)倍片段。本試劑盒采用TUNEL（TdTmediated dUTP Nick End Labeling）法，工作原理在于：DNA分子斷裂產(chǎn)生的3′-羥基（3′-OH）末端可以在末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT, Terminal Deoxynucleotidyl Transferase）的催化下結(jié)合熒光素-12-脫氧三磷酸尿苷（FITC-12-dUTP），F(xiàn)ITC-12- dUTP標(biāo)記的DNA可以用熒光顯微鏡直接觀察或者用流式細(xì)胞儀定量分析，從而反映細(xì)胞凋亡水平。

本試劑盒對(duì)標(biāo)記反應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化，采用最佳比例的熒光素標(biāo)記和未標(biāo)記的dNTP進(jìn)行3’-OH末端的核苷酸摻入，使得同一個(gè)斷裂的DNA片段末端可以形成更長(zhǎng)的“標(biāo)記尾巴"，該“標(biāo)記尾巴"減少了相鄰摻入dNTP上標(biāo)記基團(tuán)的空間位阻，增加了每個(gè)斷裂片段末端的熒光基團(tuán)數(shù)目，降低了熒光基團(tuán)相鄰后可能造成的聚集和淬滅，從而提高檢測(cè)靈敏度，減少非特異性反應(yīng)。

本試劑盒應(yīng)用廣泛，適用于檢測(cè)冰凍切片、石蠟切片，貼壁細(xì)胞以及懸浮細(xì)胞的凋亡情況。

產(chǎn)品組成

保存與運(yùn)輸方法

保存：-20℃保存，1年有效。注意：FITC-12-dUTP Labeling Mix（MX3216-B）需避光保存。

運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1） 極少數(shù)細(xì)胞凋亡不會(huì)發(fā)生DNA斷裂，此時(shí)不適用于TUNEL法檢測(cè)。另，少數(shù)類型的壞死細(xì)胞中也可能發(fā)現(xiàn)DNA斷裂，檢測(cè)出TUNEL陽(yáng)性。如果實(shí)驗(yàn)要求嚴(yán)格判定細(xì)胞凋亡，建議同時(shí)檢測(cè)多個(gè)凋亡指標(biāo)，比如Annexin V早期凋亡檢測(cè)，Caspase凋亡蛋白活性檢測(cè)。

2） 熒光物質(zhì)易發(fā)生淬滅，試劑儲(chǔ)存和操作過(guò)程中盡量避光。熒光檢測(cè)時(shí)也盡量縮短觀察時(shí)間。

3） 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法（TUNEL染色）

一、 石蠟包埋組織切片的實(shí)驗(yàn)流程

1.1樣本預(yù)處理（石蠟包埋組織切片）

1.1.1 室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5~10min，重復(fù)一次，以徹di脫掉石蠟。

1.1.2 室溫下用無(wú)水乙醇浸泡切片5min，重復(fù)一次。

1.1.3室溫下用梯度乙醇（90%、80%、70%）各浸泡潤(rùn)洗1次，每次3min。

1.1.4用PBS浸泡潤(rùn)洗切片，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。

1.1.5 按照1:100的比例，用PBS稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液，使其終濃度為20μg/ml。每個(gè)樣本上滴加100μl稀釋好的Proteinase K溶液（20μg/ml），使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫孵育20min。

1.1.6用PBS浸泡潤(rùn)洗樣本3次，每次5min，輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤(rùn)。

1.2【可選步驟】陽(yáng)性對(duì)照-DNase I處理

【注意：僅陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行此步驟，其他樣本直接進(jìn)入步驟1.3標(biāo)記及檢測(cè)】

1.2.1按1:10的比例，用ddH2O稀釋10× DNase I Buffer到1× DNase I Buffer備用。

1.2.2滴加100μl 1× DNase I Buffer到已通透的樣本上，室溫平衡5min。

1.2.3用1× DNase I Buffer稀釋DNase I (2 U/μl=2000 U/ml)，使其終濃度為20 U/ml。

1.2.4輕輕洗掉樣本上的多余液體，滴加100μl 稀釋好的DNase I（20 U/ml）工作液，室溫孵育10min。

1.2.5輕輕洗掉多余液體，并且將切片放入裝有PBS的染色缸中徹di浸泡潤(rùn)洗2~3次。

1.3標(biāo)記及檢測(cè)

1.3.1按1:5的比例，用ddH2O稀釋5×Equilibration Buffer到1×Equilibration Buffer。

1.3.2每個(gè)樣本滴加100μl 1×Equilibration Buffer，使其覆蓋全部待檢區(qū)域，室溫平衡10~30min。

1.3.3平衡期間于避光條件下按照下表配制標(biāo)記反應(yīng)液。

1.3.4平衡結(jié)束后，用吸水紙吸掉1×Equilibration Buffer，然后在樣本上滴加50μl 新鮮配制的標(biāo)記反應(yīng)液，注意避光。

1.3.5在避光的黑色濕盒底部放上用水浸濕的紙巾。將載玻片置于濕盒內(nèi)，37℃孵育60min。

1.3.6輕輕去掉多余液體，用新鮮的PBS清洗2次，每次室溫孵育5min。

1.3.7用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。

1.3.8用新鮮配制的PI溶液（1μg/ml in PBS）或DAPI溶液（2μg/ml in PBS）在黑暗中對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)染，室溫避光孵育5min。

1.3.9洗滌樣本，將載玻片浸入PBS溶液中清洗3次，每次5min。

1.3.10輕輕洗掉多余液體，并且向樣本區(qū)域滴加適量抗熒光淬滅劑，進(jìn)行封片。

1.3.11立即在熒光顯微鏡下分析樣本，在517nm熒光下觀察綠色熒光，在＞620nm熒光下觀察PI的紅色熒光，或在460nm處觀察DAPI的藍(lán)色熒光。

二、 冰凍組織切片的實(shí)驗(yàn)流程

2.1樣本預(yù)處理（冰凍組織切片）

2.1.1 將冰凍切片置于片架上，室溫晾干20min。

2.1.2 將玻片浸沒(méi)在4%多聚甲quan溶液（溶于PBS）（比如：MM1504-100ML）中固定，室溫固定30min。

2.1.3輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。

2.1.4將玻片浸沒(méi)在PBS溶液中清洗兩次，每次5min。

2.1.5輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。

2.1.6用PBS制備0.2% Triton X-100。每個(gè)樣本上滴加100μl 0.2% Triton X-100，使其覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫孵育15min。如果通透效果不好，則：按照1:100的比例，用PBS稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液，使其終濃度為20μg/ml。每個(gè)樣本上滴加100μl稀釋好的Proteinase K溶液（20μg/ml），使其覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫孵育10min。

2.1.7用PBS溶液潤(rùn)洗樣本2-3次，每次5min，輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保持濕潤(rùn)。

2.2 【可選步驟】陽(yáng)性對(duì)照-DNase I處理

【注意：僅陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行此步驟，其他樣本直接進(jìn)入步驟2.3標(biāo)記及檢測(cè)】

2.2.1按1:10的比例，用ddH2O稀釋10× DNase I Buffer到1× DNase I Buffer備用。

2.2.2滴加100μl 1× DNase I Buffer到已通透的樣本上，室溫平衡5min。

2.2.3用1× DNase I Buffer稀釋DNase I (2 U/μl=2000 U/ml)，使其終濃度為20 U/ml。

2.2.4輕輕洗掉樣本上的多余液體，滴加100μl 稀釋好的DNase I（20 U/ml）工作液，室溫孵育10min。

2.2.5輕輕洗掉多余液體，并且將切片放入裝有PBS的染色缸中徹di浸泡潤(rùn)洗2~3次。

2.3標(biāo)記及檢測(cè)

2.3.1按1:5的比例，用ddH2O稀釋5×Equilibration Buffer到1×Equilibration Buffer。

2.3.2每個(gè)樣本滴加100μl 1×Equilibration Buffer，使其覆蓋全部待檢區(qū)域，室溫平衡10~30min。

2.3.3平衡期間于避光條件下按照下表配制標(biāo)記反應(yīng)液。

2.3.4平衡結(jié)束后，用吸水紙吸掉1×Equilibration Buffer，然后在樣本上滴加50μl 新鮮配制的標(biāo)記反應(yīng)液，注意避光。

2.3.5在避光的黑色濕盒底部放上用水浸濕的紙巾。將載玻片置于濕盒內(nèi)，37℃孵育60min。

2.3.6輕輕去掉多余液體，用新鮮的PBS清洗2次，每次室溫孵育5min。

2.3.7用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。

2.3.8用新鮮配制的PI溶液（1μg/ml in PBS）或DAPI溶液（2μg/ml in PBS）在黑暗中對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)染，室溫避光孵育5min。

2.3.9洗滌樣本，將載玻片浸入PBS溶液中清洗3次，每次5min。

2.3.10輕輕洗掉多余液體，并且向樣本區(qū)域滴加適量抗熒光淬滅劑，進(jìn)行封片。

2.3.11立即在熒光顯微鏡下分析樣本，在517nm熒光下觀察綠色熒光，在＞620nm熒光下觀察PI的紅色熒光，或在460nm處觀察DAPI的藍(lán)色熒光。

三、 貼壁細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)流程

3.1樣本預(yù)處理（貼壁細(xì)胞）

3.1.1實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

◇ 細(xì)胞爬片的準(zhǔn)備

在Lab-Tek載玻片小室或TC處理的細(xì)胞爬片上培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。在凋亡誘導(dǎo)處理之后，用PBS清洗載玻片2次，進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

◇ 細(xì)胞涂片的制備

以2×106 cells/ml的濃度將細(xì)胞重懸于PBS中。吸取50~100 μl 細(xì)胞懸液滴于多聚賴氨酸包被的載玻片上。用一片干凈的載玻片輕柔的涂開(kāi)細(xì)胞懸液，進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.1.2 將爬片或涂片浸入裝有4%多聚甲醛（溶于PBS）（比如：MM1504-100ML）的染色缸中，4℃放置25min，以固定細(xì)胞。

3.1.3 將爬片或涂片浸入PBS中清洗2次，每次室溫放置5min。

3.1.4 輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干爬片或涂片上樣本周圍多余的液體。

3.1.5 將爬片或涂片浸入0.2% Triton X-100（in PBS），室溫孵育5min進(jìn)行通透處理。

3.1.6用PBS潤(rùn)洗樣本2-3次，每次3-5min，輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保存濕潤(rùn)。

3.2【可選步驟】陽(yáng)性對(duì)照-DNase I處理

【注意：僅陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行此步驟，其他樣本直接進(jìn)入步驟3.3標(biāo)記及檢測(cè)】

3.2.1按1:10的比例，用ddH2O稀釋10× DNase I Buffer到1× DNase I Buffer備用。

3.2.2滴加100μl 1× DNase I Buffer到已通透的樣本上，室溫平衡5min。

3.2.3用1× DNase I Buffer稀釋DNase I (2 U/μl=2000 U/ml)，使其終濃度為20 U/ml。

3.2.4輕輕洗掉樣本上的多余液體，滴加100μl 稀釋好的DNase I（20 U/ml）工作液，室溫孵育10min。

3.2.5輕輕洗掉多余液體，并且將爬片或涂片放入裝有PBS的染色缸中徹di浸泡潤(rùn)洗2~3次。

3.3標(biāo)記及檢測(cè)

3.3.1按1:5的比例，用ddH2O稀釋5×Equilibration Buffer到1×Equilibration Buffer。

3.3.2每個(gè)樣本滴加100μl 1×Equilibration Buffer，使其覆蓋全部待檢區(qū)域，室溫平衡10~30min。

3.3.3平衡期間于避光條件下按照下表配制標(biāo)記反應(yīng)液。

3.3.4平衡結(jié)束后，用吸水紙吸掉1×Equilibration Buffer，然后在樣本上滴加50μl 新鮮配制的標(biāo)記反應(yīng)液，注意避光。

3.3.5在避光的黑色濕盒底部放上用水浸濕的紙巾。將載玻片置于濕盒內(nèi)，37℃孵育60min。

3.3.6輕輕去掉多余液體，用新鮮的PBS清洗2次，每次室溫孵育5min。

3.3.7用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。

3.3.8用新鮮配制的PI溶液（1μg/ml in PBS）或DAPI溶液（2μg/ml in PBS）在黑暗中對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)染，室溫避光孵育5min。

3.3.9洗滌樣本，將載玻片浸入PBS溶液中清洗3次，每次5min。

3.3.10輕輕洗掉多余液體，并且向樣本區(qū)域滴加適量抗熒光淬滅劑，進(jìn)行封片。

3.3.11立即在熒光顯微鏡下分析樣本，在517nm熒光下觀察綠色熒光，在＞620nm熒光下觀察PI的紅色熒光，或在460nm處觀察DAPI的藍(lán)色熒光。

四、 懸浮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)流程

4.1將（3~5）×106個(gè)細(xì)胞用PBS清洗2次，每次于4℃，1800rpm（300×g）離心5min，然后，用0.5mlPBS重懸。

4.2加入5ml 1%多聚甲醛（in PBS），4℃孵育20min進(jìn)行細(xì)胞固定。

4.3于4℃，1800rpm（300×g）離心5min，棄上清，用5ml PBS重懸細(xì)胞。

4.4重復(fù)離心并用0.5ml PBS重懸細(xì)胞。

4.5加入5ml 0.2% Triton X-100（in PBS），室溫通透5min；或加入5ml冰上預(yù)冷的70%乙醇，在-20℃孵育4h。

4.6于4℃，1800rpm（300×g）離心5min，棄上清，用5ml PBS重懸細(xì)胞。重復(fù)離心并用1ml PBS重懸細(xì)胞。

4.7轉(zhuǎn)移2×106個(gè)細(xì)胞到新的1.5ml離心管。

4.8于4℃，1800rpm（300×g）離心5min，棄上清，并且用100μl 1×Equilibration Buffer【于使用前，按1:5的比例用ddH2O稀釋5×Equilibration Buffer】重懸細(xì)胞。室溫孵育5min。

4.9平衡期間于避光條件下按照下表配制標(biāo)記反應(yīng)液。冰上融化FITC-12-dUTP Labeling Mix。

4.10于4℃，1800rpm（300×g）離心5min，棄上清，用50μl 新鮮配制的標(biāo)記反應(yīng)液重懸細(xì)胞。37℃避光孵育60min，每隔15min輕彈管壁或用微量移液器輕輕重懸細(xì)胞。

4.11加入1ml 20mM EDTA終止反應(yīng)，用移液器輕柔混勻。

4.12于4℃，1800rpm（300×g）離心5min，棄上清，用1ml 0.1% Triton X-100（in PBS）+5mg/ml BSA重懸細(xì)胞，重復(fù)1次，共洗2次。

4.13于4℃，1800rpm（300×g）離心5min，棄上清，用0.5ml新鮮配制的PI溶液（5μg/ml in PBS）重懸細(xì)胞，其中含250μg RNase A（DNase-free）。

4.14在黑暗中室溫孵育細(xì)胞30min。

4.15用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞?；蛴脴?biāo)準(zhǔn)的熒光濾片裝置來(lái)分析細(xì)胞。在517nm熒光下觀察綠色熒光，在＞620nm熒光下觀察PI的紅色熒光。

使用方法（TUNEL和免疫熒光共染）

一、 石蠟組織切片的共染步驟

二、 冰凍組織切片的共染步驟

三、 細(xì)胞爬片的共染步驟

常見(jiàn)問(wèn)題

1. 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量少

通透不充分，可通過(guò)調(diào)整蛋白酶K或Triton X-100的孵育時(shí)間優(yōu)化通透步驟。

2. 高背景（如未凋亡細(xì)胞的強(qiáng)綠色熒光背景）

非特異性摻入FITC-12-dUTP。處理方法：在操作過(guò)程中保持細(xì)胞潤(rùn)濕；標(biāo)記反應(yīng)完成，載玻片在用PBS洗一次后，可再用含0.1% Triton X-100和5mg/ml BSA的PBS洗3次，每次5min。

3. 組織切片從載玻片上脫落

組織切片粘附之前的包被不充分。在展片之前，用3-氨丙基三乙氧基硅烷（TESPA）包被顯微鏡載玻片，比多聚賴氨酸（PLL）的效果更好。

4. 顯微鏡或流式細(xì)胞儀分析只剩下很少的細(xì)胞

在操作過(guò)程中丟失大量細(xì)胞，處理方法：1）可以提高起始的細(xì)胞量；2）在制備細(xì)胞懸液時(shí)，離心過(guò)程中用含1% BSA的PBS清洗細(xì)胞。

5. 標(biāo)記率低

如果以乙醇或甲醇固定的樣本，則標(biāo)記效率較低。原因是：固定時(shí)染色質(zhì)未能與蛋白質(zhì)交聯(lián)，而在操作中丟失。應(yīng)該用4%多聚甲醛（in PBS）或福爾馬林或戊二醛固定。

過(guò)度的固定導(dǎo)致與蛋白質(zhì)過(guò)度交聯(lián)，也會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記效率低?？梢赃m當(dāng)縮短固定時(shí)間?；蛴?%多聚甲醛（in PBS）固定。

6. 假陽(yáng)性

某些肌組織的冰凍切片，如果制片過(guò)程中沒(méi)有經(jīng)過(guò)多聚甲醛固定，容易出現(xiàn)內(nèi)源性核酸酶切割DNA導(dǎo)致假陽(yáng)性，應(yīng)該將組織取出后及時(shí)用多聚甲醛固定，另外，盡量避免用蛋白酶K通透。

蛋白酶K工作液處理時(shí)間、溫度需摸索最適條件，溫度過(guò)高，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，容易破壞核酸結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)假陽(yáng)性。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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