農桿菌電轉感受態細胞 克隆與表達分析

EHA105(pSoup) Electrocompetent Cell

農桿菌電轉感受態細胞

產品標簽：

EHA105菌株；農桿菌感受態細胞；Rifampicin（Rif） 利fu平；Kanamycin（kan）卡那mei素；EHA101；LBA4404；GV3101；AGL1；植物轉基因研究；

產品訂購：更大包裝或產品技術問題，

產品描述：

EHA105菌株由EHA101菌株改造而來，染色體背景為C58，核基因含篩選標簽—利fu平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的琥珀堿型Ti質粒pEHA105（pTiBo542DT-DNA），此質粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA105（pTiBo542DT-DNA）質粒自身的T-DNA轉移功能雖被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移）。在EHA105菌株中轉入help質粒：pSoup，即得到：EHA105 (pSoup)菌株，可幫助pGreen，62SK，pGs2系列質粒在農桿菌中復制，同時賦予該菌株四環素（tetR）抗性，適用于水稻、煙草等植物的轉基因操作。

我司（懋康生物）提供的EHA105(pSoup)電轉感受態細胞經特殊工藝制作，特別適合大質粒的轉化。基因型為C58 (rifR) Ti pEHA105(pSoup) (pTiBo542DT-DNA) Succinamopine(pSoup-tetR)，經pGs2質粒檢測轉化效率>105cfu/μg DNA。

產品組分：

保存與運輸條件：

保存：-80℃保存，1年有效。

運輸：干冰運輸。

注意事項

1） 感受態細胞應保存在-80℃，不可反復凍融和放置時間過長，以免降低感受態細胞的轉化效率。

2） 整個轉化操作，嚴格根據相應溫度及無菌條件要求進行。

3） 加入質粒的體積不應大于感受態體積的1/10。質粒不純或存在乙醇等有機物污染，會導致轉化效率急劇下降。質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。

4） 為確保zui高轉化效率，整個操作過程應盡量輕柔，并保持低溫。

5） 轉化高濃度的質粒可相應減少最終涂板用量。

6） 平板上克隆密度過大時，由于營養不足，克隆生長變慢，菌落變小。為獲得大菌落，應減少質粒用量。

7） 培養基中加入利fu平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入鏈mei素或慶大mei素可防止Ti質粒丟失，但鏈mei素不利于農桿菌的轉基因操作，一般培養農桿菌時不考慮鏈mei素或慶大mei素，因Ti質粒丟失的概率極低（基本可以忽略）

8） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

1) 將0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈吸水紙上5min，待其瀝干水分，正置5min，使乙醇充分揮發干凈，立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5min使其充分降溫。

2) 取-80℃保存的感受態細胞插入冰中5min，待其融化。

3) 往50μl感受態細胞懸液中加入0.01~1μg（體積不大于6μl）質粒DNA，用手bo打管底使其混勻，立即插入冰中。用槍輕輕吹打混勻感受態細胞-質粒之后快速轉移到電擊杯中，蓋上杯蓋，空管保留待用【注意：由于感受態轉化效率較高，di一次使用zuihao做預試驗確定zuijia的質粒用量】。

4) 啟動電轉儀，設置參數：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數參考Bio-rad，具體使用請參考電轉儀推薦步驟來操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中。

5) 加入700 μl無抗生素的LB并轉移到感受態空管中，于28℃振蕩培養2~3h。

6) 6,000rpm離心1min，留取約 100ul上清，之后用槍輕輕吹打重懸菌體。之后加到含相應抗生素的LB或YEB平板上，用無菌玻棒輕輕的將細胞均勻涂開。室溫正置10 min，待液體被吸收后，倒置平板，28℃培養2-3天。【注意：當平板只含轉化所用雙元載體抗生素時，28℃培養48h即可；當平板中加入雙元載體抗生素的同時，再加入10μg/ml利fu平時，需28℃培養48-60h；當平板中加入雙元載體抗生素的同時，再加入20μg/ml利fu平時，需28℃培養60-72h;不建議使用超過20μg/ml的利fu平用于平板或液體培養。

7) 目的克隆的液體培養：

j小量搖菌：往15ml的圓底透氣試管中加入1ml含對應抗生素的LB液體培養基，從新鮮培養的平板上挑1-2個單菌落接種，30℃，200rpm搖菌24-48h。

k大量搖菌：100ml透氣三角瓶內加入少于20ml含對應抗生素的LB液體培養基，取小搖菌液按2%比例接菌，30℃，200rpm搖菌24-48h。

【注意】：對于農桿菌（好氧菌）來說，不論是固體平板還是液體搖菌均需要大量氧氣。液體搖菌成功的關鍵就是要保證培養基中含足夠的溶解氧，可通過以下方法來控制：j用透氣試管或三角瓶；k確保營養液有大的橫截面和小的厚度；l抗生素盡量少加或不加，必須添加的抗生素盡量使用低濃度。

相關產品【感受態細胞系列】

附表1固體和液體LB培養基配方

附表2固體和液體YEB培養基配方

附表3常見農桿菌對抗生素敏感性總表

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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