大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)分析

SURE2 Chemically Competent Cell 大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品標(biāo)簽：

SURE；SURE-2；Stbl3；Stable；Direct repeats正向重復(fù)片段；Retroviral sequences 逆轉(zhuǎn)錄病毒序列；Stratagene;

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產(chǎn)品組分：

菌株描述

SURE2菌株是Agilent (Stratagene) SURE菌株的高效衍生菌，特別設(shè)計(jì)用于克隆在傳統(tǒng)的大腸桿菌中 “無(wú)法克隆”的某些DNA  p段。SURE菌株破壞了重組酶系統(tǒng)整條通路上的組分，這些組分能催化重組和刪除體內(nèi)的非標(biāo)準(zhǔn)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，包括十字形（由反向重復(fù)序列引起）和Z字形的DNA，經(jīng)常出現(xiàn)在真核生物DNA中，能阻止真核DNA克隆進(jìn)入傳統(tǒng)大腸桿菌菌株中。SURE2菌株含限制缺陷（McrA-, McrCB-, McrF-, Mrr-, HsdR-），使其無(wú)法對(duì)外源DNA進(jìn)行標(biāo)記和限制，從而提高外源甲基化DNA的克隆效率。

也含內(nèi)切酶缺陷（endA），和重組缺陷（recB recJ），提高了外源DNA的穩(wěn)定性。存在于F´因子上的lacIqZΔM15使菌株適用于藍(lán)白斑。SURE2菌株本身含卡那mei素、四環(huán)素和氯mei素特性。

SURE2菌株基因型：e14-(McrA-) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1 gyrA96 thi-1 supE44 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kanr) uvrC [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr) Amy Camr].

產(chǎn)品描述

本品是SURE2菌株經(jīng)特殊工藝制作所得的感受態(tài)細(xì)胞，可用于DNA的熱擊轉(zhuǎn)化。經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率＞1×109 cfu/μg DNA。且在-80℃能穩(wěn)定保存幾個(gè)月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。

保存與運(yùn)輸條件：

保存：-80℃保存，六個(gè)月有效。

運(yùn)輸：干冰運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1） 感受態(tài)細(xì)胞必須用干冰運(yùn)輸。感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)在-80℃保存，不可反復(fù)凍融且放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)減低感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

2） 最好在冰上融化感受態(tài)細(xì)胞。

3） 進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作時(shí)，需在相應(yīng)溫度及無(wú)菌條件下進(jìn)行。

4） 轉(zhuǎn)化高濃度質(zhì)粒或高效率連接產(chǎn)物可相應(yīng)降低最終用于涂板的菌量。

5） 菌株本身含卡那mei素、四環(huán)素和氯mei素特性，攜帶此三種抗性的質(zhì)粒不適合克隆到SURE2細(xì)胞。SURE2菌株能耐受＜40μg/ml氯mei素，但對(duì)100μg/ml 氯mei素很敏感。

6） 為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功，可保留部分連接反應(yīng)液以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到zui低。

7） 產(chǎn)品包裝內(nèi)含質(zhì)粒pUC19 DNA(10 pg/μl)，供對(duì)照實(shí)驗(yàn)用。

8） 要想獲得大量高純度質(zhì)粒，建議在TB培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)（以pUC19為例，在TB培養(yǎng)液中過(guò)夜培養(yǎng)的菌體濃度和質(zhì)粒產(chǎn)率是LB培養(yǎng)液的3~4倍，S.O.C培養(yǎng)液的~2倍）。

9） 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

常規(guī)操作流程【所有操作均在無(wú)菌條件的標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行】

1） 從-80℃取出感受態(tài)細(xì)胞，迅速插入冰中5min待其融化。

2） 向融化的感受態(tài)細(xì)胞中加入目的DNA（根據(jù)實(shí)際情況加入適量的DNA，通常100 μl感受態(tài)細(xì)胞能夠被1 ng超螺旋質(zhì)粒DNA所飽和），用手輕彈混勻（避免用移液槍上下吹打），冰浴靜置25min。

3） 42℃水浴熱激45s，迅速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰上靜置2min。此過(guò)程不要搖動(dòng)離心管。

4） 向每個(gè)離心管中加入700 μl無(wú)菌的2YT或LB培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于37℃ 搖床，200 rpm振蕩培養(yǎng)60min，目的使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。

5） 5000rpm離心1min，留取100μl左右輕輕吹打重懸菌體，加到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無(wú)菌的涂布棒將細(xì)胞均勻涂開，將平板置于室溫（或37℃）直至液體被吸收，倒置培養(yǎng)，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

【注意】：a）涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)調(diào)整。若轉(zhuǎn)化的DNA總量較多，可取少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板；反之，若轉(zhuǎn)化的DNA總量較少，可將所有轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板。b）新制備的固體培養(yǎng)基不易涂干，可將平板正置于37℃直至液體被吸收后再倒置培養(yǎng)。c）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過(guò)少， 

附表1固體和液體LB培養(yǎng)基配方

附表2固體和液體2-YT培養(yǎng)基配方

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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