AGL1 農桿菌電轉感受態細胞

AGL1 Electrocompetent cell 農桿菌電轉感受態細胞

產品標簽：

AGL1菌株；農桿菌感受態細胞；Rifampicin（Rif） 利fu平；Kanamycin（kan）卡那mei素； EHA101；LBA4404；GV3101；植物轉基因研究；

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產品描述：

AGL1菌株的染色體背景為C58，RecA，核基因含利fu平抗性基因rif和羧芐青mei素抗性基因carb，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的琥珀堿型Ti質粒pTiBo542DT-DNA，此質粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pTiBo542DT-DNA質粒自身的T-DNA轉移功能雖被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移）。AGL1菌株適用于擬南芥、水稻、楊樹等植物的轉基因操作。

我司懋康生物提供的AGL1電轉感受態細胞經特殊工藝制作，特別適合大質粒的轉化?；蛐?/span>C58 RecA (rif^R/carb^R) Ti pTiBo542DT-DNA Succinamopine，經pCAMBIA2301質粒檢測轉化效率>10⁵ cfu/μg DNA。

產品組分：

注意事項

1）   感受態細胞應保存在-80℃，不可反復凍融和放置時間過長，以免降低感受態細胞的轉化效率。

2）   整個轉化操作，嚴格根據相應溫度及無菌條件要求進行。

3）   加入質粒的體積不應大于感受態體積的1/10。質粒不純或存在乙醇等有機物污染，會導致轉化效率急劇下降。質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。

4）   為確保zui高轉化效率，整個操作過程應盡量輕柔，并保持低溫。

5）   轉化高濃度的質粒可相應減少zui終涂板用量。

6）   平板上克隆密度過大時，由于營養不足，克隆生長變慢，菌落變小。為獲得大菌落，應減少質粒用量。

7）   利fu平濃度應≤25μg/ml，過高濃度不利于農桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。我司EHA101感受態計算轉化效率時所用平板只含50μg/ml卡那mei素，若所用平板含20μg/ml 利fu平，則轉化效率降低到1/2。

8）   培養基中加入利fu平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入Ti質粒篩選抗生素可防止Ti質粒丟失，但這些篩選抗生素不利于農桿菌的轉基因操作，所以一般培養農桿菌時不考慮這些篩選抗生素，因Ti質粒丟失的概率極低（基本可以忽略）。

9）   為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

1)        將0.1 cm店擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈吸水紙上5min，待其瀝干水分，正置5min，使乙醇充分揮發干凈，立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5min使其充分降溫。

2)        取-80℃保存的感受態細胞于室溫或手心片刻待其部分融化，達到冰水混合狀態時插入冰浴中使其*融化。

3)        往50μl感受態細胞懸液中加入0.01~1μg（體積不大于6μl）質粒DNA，用手管底使其混勻，立即插入冰中。用槍輕輕吹打混勻感受態細胞-質粒之后快速轉移到店擊杯中，蓋上杯蓋，空管保留待用【注意：由于感受態轉化效率較高，*次使用做預試驗確定zui加的質粒用量】。

4)        啟動電轉儀，設置參數：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數參考Bio-rad，具體使用請參考電轉儀推薦步驟來操作），將店擊杯快速放入電轉槽中，店擊完成快速插入冰中。

5)        加入700 μl無抗生素的LB并轉移到感受態空管中，于28℃振蕩培養2~3h。

6)        6,000rpm離心1min，吸掉600ul上清，之后用槍輕輕吹打重懸菌體。之后加到含相應抗生素的LB或YEB平板上，用無菌玻棒輕輕的將細胞均勻涂開。室溫正置10 min，待液體被吸收后，倒置平板，28℃培養2-3天。【注意：當平板只含轉化所用雙元載體抗生素時，28℃培養48h即可；當平板中加入雙元載體抗生素的同時，再加入20μg/ml 利fu平時，需28℃培養60h；若使用的平板含50μg/ml 利fu平，需在28℃培養72-90h?！?/span>

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附表1 固體和液體LB培養基配方

附表2 固體和液體YEB培養基配方

附表3常見農桿菌對抗生素敏感性總表

— —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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