對(duì)潮霉素B Hygromycin B的抗性基因：

　　對(duì)潮霉素B的抗性源自編碼潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hph)的基因。至今發(fā)現(xiàn)兩種來(lái)源：

　　1.Streptomyces hygroscopicus產(chǎn)生的Hph抗性基因;

　　2.Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae內(nèi)質(zhì)粒攜帶的Hph抗性基因(常用);

　　潮霉素B Hygromycin B的生物應(yīng)用：

　　1) 篩選和維持培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hph+載體的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞(植物細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞);

　　2) 由于作用模式的差異，常與G418 (GeneticinTM)，Zeocin™ 和blasticidin S聯(lián)合使用，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩個(gè)不同載體的細(xì)胞株;

　　3)抗病毒劑，由于潮霉素B選擇性滲透進(jìn)入病毒感染增強(qiáng)通透性的細(xì)胞，而且具有抑制翻譯的功效;

　　4)作為驅(qū)蟲(chóng)藥加入動(dòng)物飼料;

　　應(yīng)用濃度：

　　潮霉素B用來(lái)篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株的工作濃度需要根據(jù)細(xì)胞類型，培養(yǎng)基，生長(zhǎng)條件和細(xì)胞代謝率而變化。推薦使用濃度為50-1000 μg/mL，濃度需要?dú)缜€來(lái)確定。

　　哺乳動(dòng)物細(xì)胞·200-500 μg/mL;細(xì)菌/植物細(xì)胞·100-300 μg/mL;真菌·300-1000 μg/mL;

　　潮霉素B Hygromycin B的兩種使用方法如下：

　　使用一：殺滅曲線確定殺死濃度(僅作參考，因個(gè)人檢測(cè)體系而異)

　　(1)往組織培養(yǎng)級(jí)的96孔板內(nèi)加入未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞密度約50-200細(xì)胞/孔;細(xì)胞貼壁之后，往每孔加入含不同濃度(如50-1000μg/mL，至少5個(gè)濃度)潮霉素B的200μL新鮮培養(yǎng)基;

　　(2)37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞10-14天;

　　(3)培養(yǎng)5-7天后更換新的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液內(nèi)含有相應(yīng)濃度的潮霉素B;

　　(4)10-14天后使用細(xì)胞增殖方法如MTT，CCK-8等評(píng)估細(xì)胞活力;也可以通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞克隆數(shù)或百分比匯合率來(lái)確定毒性效應(yīng)。一般選擇在10-14天能夠殺死所有細(xì)胞的小濃度為篩選濃度。

　　使用二：篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞

　　(1) 對(duì)于貼壁細(xì)胞，直接吸去60mm培養(yǎng)皿內(nèi)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基，然后加入含有潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基5-6ml;對(duì)于懸浮細(xì)胞，無(wú)菌條件250x g,離心10min除去舊的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基，然后懸浮在約5ml的含潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基;

　　(2) 5-7天后，如上方法更換含有潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基;

　　(3) 再孵育細(xì)胞5-7天;

　　(4) 10-14天孵育后，培養(yǎng)體系中只含有能夠表達(dá)潮霉素B抗性表型的活細(xì)胞。因此篩選之后如步驟一，更換不含潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基。