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          科普一下鈣離子熒光探針系列的三種使用方法

            科普一下鈣離子熒光探針系列的三種使用方法

            1、貼壁細(xì)胞

            A. 取普通潔凈蓋玻片于70%乙醇中浸泡5分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間,無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)吹干或用細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)PBS或0.9%NaCl等溶液洗滌三遍,再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔板內(nèi),種入細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜,使約為50%-80%滿(mǎn)。

            B. 刺激細(xì)胞發(fā)生凋亡后,吸盡培養(yǎng)液,加入0.5ml固定液,固定10分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可4℃過(guò)夜)。

            C. 去固定液,用PBS或0.9%NaCl洗兩遍,每次3分鐘,吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床,或手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。

            D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液,染色5分鐘。也宜用搖床,或手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。

            E. 用PBS或0.9%NaCl洗兩遍,每次3分鐘。

            F. 滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上,蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片,盡量避免氣泡。使細(xì)胞接觸封片液,切勿弄反。

            G. 熒光顯微鏡可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長(zhǎng)在350nm左右,發(fā)射波長(zhǎng)在460nm左右,詳細(xì)圖譜請(qǐng)參考下圖。

            2、懸浮細(xì)胞

            A. 離心收集細(xì)胞樣品于1.5ml離心管內(nèi),加入0.5ml固定液,緩緩懸起細(xì)胞,固定10分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可4℃過(guò)夜)。

            B. 離心去固定液,用PBS或0.9%NaCl洗兩遍,每次3分鐘。洗滌期間手動(dòng)晃動(dòng)。

            C. 后一次離心后吸去大部分液體保留約50ml液體,再緩緩懸起細(xì)胞,滴加至載玻片上,盡量使細(xì)胞分布均勻。

            D. 稍晾干,使細(xì)胞貼在載玻片上不易隨液體流動(dòng)。

            E. 均勻滴上0.5ml Hoechst 33258染色液,染色5分鐘。用吸水紙從邊緣吸去液體,微晾干。

            F. 用PBS或0.9%NaCl洗兩遍,每次3分鐘。

            G. 滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上,蓋上一潔凈的蓋玻片,盡量避免氣泡。

            H. 熒光顯微鏡可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長(zhǎng)在350nm左右,發(fā)射波長(zhǎng)在460nm左.

            3、組織切片

            A. 對(duì)于任何常見(jiàn)切片,處理至常規(guī)可以進(jìn)行免疫染色時(shí),或完成常規(guī)的免疫染色后,即可進(jìn)行后續(xù)的Hoechst染色。B. PBS或0.9%NaCl洗兩遍,每次3分鐘,吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床,或手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。可在六孔板中操作。

            C. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液,染色5分鐘。也宜用搖床,或手動(dòng)晃動(dòng)。

            D. 用PBS或0.9%NaCl洗兩遍,每次3分鐘。

            E. 將切片置于載玻片上,滴一滴抗淬滅封片液,蓋上一潔凈的蓋玻片,盡量避免氣泡。

            F. 熒光顯微鏡可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長(zhǎng)在350nm左右,發(fā)射波長(zhǎng)在460nm左右,

            Hoechst 33258的吸收光譜和發(fā)射光譜,左側(cè)峰為吸收光譜,右側(cè)峰為發(fā)射光譜。

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