Staining Cell Surface Targets For Flow Cytometry

細胞表面抗原免疫熒光染色（流式分析）

細胞表面抗原免疫熒光染色-流式分析步驟：

此步驟做交流學習用，具體的實驗方案因實驗而異。

A．組織和細胞收集

1. 收集理想組織（如脾臟、淋巴結、胸腺、骨髓）并制備懸浮于細胞染色緩沖液（cell staining buffer）的單細胞懸液。如果使用體外刺激細胞，只需將刺激活化的細胞簡單懸浮于細胞染色緩沖液（cell staining buffer）。
2. 加細胞染色緩沖液（cell staining buffer）高達~15ml，然后350xg離心5min，吸掉上清。

B．紅細胞裂解

1. 用3ml 紅細胞裂解液（1× RBC Lysis Buffer）重懸細胞或根據具體情況加入相應量的紅細胞裂解液。冰上孵育5min。
2. 加10ml細胞染色緩沖液（cell staining buffer）到管內終止細胞裂解，然后350xg離心5min，吸掉上清。
3. 如步驟2重復一次清洗。
4. 細胞計數，用細胞染色緩沖液沖重懸細胞使濃度為5-10 x 10⁶ cells/ml，按照100µl/管分裝細胞懸液到12 x 75mm塑料管中（5-10 x 10⁵ cells/ml）。

C．Fc受體封閉

1. 阻斷Fc受體的試劑適用于降低非特異性免疫熒光染色。小鼠樣本，使用特異性結合FcγR III/II的TruStain FcX™ (anti-mouse CD16/32) 抗體可用于封閉抗體的非特異性染色。此種情況下，100 µl染色體積按照每10⁶個細胞加入1µg TruStain FcX™ (anti-mouse CD16/32) 抗體，混勻，冰上孵育5-10min。
2. 人樣本，每100 µl染色體積加入5µl Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution，Fc受體封閉劑)，混勻，室溫孵育5-10min。在不含有有效/可得的封閉抗體情況下，使用過量的相同物種來源的純化IgG和免疫熒光染色用抗體相同來源的IgG亞型作為替代方法來封閉細胞。

D．抗體的細胞表面染色

1. 按照預先優化的濃度，加入合適的熒光素、生物素偶聯抗體或純化的一抗（如： anti-CD3-FITC, anti-CD4-Biotin, and anti-CD8-APC），冰上避光孵育15-20min。
2. 至少使用2ml細胞染色緩沖液（cell staining buffer）清洗細胞，350xg離心5min，吸掉上清。重復一次。
3. 如果使用純化的一抗，需在殘留的緩沖液中重懸細胞，加入預先優化濃度的熒光二抗，冰上避光孵育15-20min。
4. 重復步驟10。
5. 用0.5ml細胞染色緩沖液（cell staining buffer）重懸細胞，每10⁶個細胞加入5µl（0.25µg）7-AAD染色液（ 7-AAD Viability Staining Solution）對死細胞染色。
6. 避光冰上孵育3-5min。
7. 用流式細胞儀分析結果。【注意】：如果不能立即使用流式細胞儀分析樣品，避光保存樣品，并且置于4-8℃保存。樣品必須重懸于細胞染色液中。注意細胞樣品不應該放在固定緩沖液更長時間，因其會影響熒光素構象和熒光信號。

實驗材料：